Core facility Hmotnostní spektrometrie biopolymerů (BioMS) poskytuje servisní analýzy proteinů a dalších biomolekul založené na hmotnostně-spektrometrické detekci. Zajišťujeme identifikaci, charakterizaci a kvantifikaci purifikovaných proteinů, bandů z SDS-PAGE, imunoprecipitací, buněčných lyzátů a podobných vzorků. Analyzujeme taktéž posttranslační modifikace, včetně globálních fosfoproteomů. Aktuálně také vyvíjíme metody pro analýzu nukleových kyselin a jejich komplexů s proteiny. Kromě rutinně používaných proteomických postupů máme k dispozici také metody strukturní hmotnostní spektrometrie k charakterizaci protein-proteinových a protein-ligandových interakcí, jako jsou analýza nativní hmoty proteinů a jejich komplexů, zesíťování proteinů (chemical crosslinking) a vodík-deuteriová výměna (HDX-MS).

Pro založení žádosti o analýzu použijte požadavkový systém reQuest.

Služby

Bottom-up proteomická analýza

Analýza se zaměřuje především na identifikaci proteinů, jejich postranslačních modifikací a/nebo na provedení kvantifikace proteinů, a to buď pomocí metody založené na izotopových značených molekulách či na metodě nevyužívající izotopového značení (label-free). Postup spočívá v proteolytickém štěpení proteinů a analýze získaných peptidů. Samotná analýza je založena kapalinové chromatografii propojené s hmotnostně-spektrometrickou analýzou peptidů provedenou ve vysokém rozlišení. To umožňuje citlivou a spolehlivou identifikaci/kvantifikaci proteinů či jejich modifikací v analyzovaném vzorku. Proteiny je možné analyzovat v různých formách. Jsme schopni analyzovat jak vysušené vzorky proteinů, tak proteiny separované v SDS-PAGE gelu či proteiny rozpuštěné v různých pufrech.

Pozn.: V případě, že jste nový zákazník nebo si nejste jisti, zda je váš úkol kompatibilní s našimi možnostmi, prosíme, abyste nejprve kontaktovali operátory pro vhodné nastavení analýzy či celého proteomického experimentu.

Operátoři:

• Jana Březinová
• Alena Meledina
• Michal Korecký
• Alena Křenková

Top-down proteomické analýzy

Intaktní hmota

Analýza celé hmoty proteinů nebo nukleových kyselin za denaturačních podmínek. Slouží jako přesnější obdoba SDS-PAGE s přesností určení hmoty do 1 Da.

Možnosti uplatnění:

• Kontrola správné exprese proteinů podle celkové hmoty
• Detekce a relativní kvantifikace kovalentních modifikací
• Detekce kovalentních protein-proteinových nebo protein-ligandových komplexů

Je možné analyzovat jak čisté proteiny či nukleové kyseliny, tak jednodušší směsi (do třeba 10-20 čistých proteinů). Analýza složitějších směsí, nebo vzorku s velkým množstvím proteoform jednoho proteinu, může být problematická, nicméně je možnost provést LC-MS separaci vzorku před analýzou. Analyzovat je možné i větší proteiny, jako jsou protilátky. Poskytujeme také výpočet Drug-to-Antibody Ratio (DAR) pro antibody-drug konjugáty jako servis.

Požadavky:

• Minimálně 5 µg proteinu v 50 µl objemu
• Přesné složení pufru ve vzorku (běžné pufry jsou OK, ale BEZ detergentů!)
• Vzorek ideálně redukovaný pomocí 5 mM TCEP, pokud není nutné zachovat disulfidy
• Očekávaná hmota proteinu / nukleové kyseliny / komplexu
• Očekávaná hmota modifikací / ligandů

Operátoři:

• František Filandr
• Petra Junková

Nativní MS

Nativní hmotnostní spektrometrie umožňuje studium nekovalentních protein-protein či protein-ligandových komplexů za biologický relevantních „nativních“ podmínek. Analýza probíhá za velmi jemné ionizace, které umožňuje přenést celý nekovalentní komplex z roztoku až na detektor hmotnostního spektrometru.

Možnosti uplatnění:

• Potvrzení protein-proteinové, nebo protein-ligandové interakce
• Informace o stechiometrii komplexů
• Přítomnosti a relativní kvantifikace post translačních modifikací
• Sledování strukturních změn na proteinech/komplexech za různých podmínek

Požadavky:

• Minimálně 5-10 µM roztok proteinu/komplexu ve 20 µl objemu
• Ultra čistý protein v 10-100 mM ammonium acetátu, bez jakýchkoli dalších látek kromě ligandů, vyhnout se DMSO (alternativa je MeOH, nebo EtOH na rozpouštění ligandů)
• Informace o přesném složení pufru ve vzorku
• Očekávaná hmota proteinu / nukleové kyseliny / komplexu
• Očekávaná hmota modifikací / ligandů

Operátoři:

• Tereza Nešporová
• František Filandr

Strukturně-proteomické analýzy

Tyto komplementární metody umožňují studovat proteinové struktury a charakterizovat nejen interakce mezi proteiny, ale také interakce proteinů s jinými biologickými molekulami nebo nízkomolekulárními látkami.

HDX-MS

Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) je strukturně proteomické metoda založená na chemické reakci umožňující výměnu kovalentně vázaných atomů vodíku za deuterium z roztoku. Tato výměna probíhá za fyziologických podmínek a její rychlost závisí na lokální sekundární struktuře proteinů. Při provedení diferenčního experimentu za různých podmínek je možné sledováním rychlosti výměny na peptidové úrovni lokalizovat strukturní změny na proteinech vlivem vazby ligandu (identifikace vazebného místa), jiného proteinu (identifikace interakčního rozhraní), nebo vlivem změny fyzikálně-chemických podmínek (teplota, pH) včetně doprovodných alosterických jevů.

Požadavky:

• Alespoň 50 µg proteinu pro každou z porovnávaných podmínek
• Jakýkoli pufr bez detergentů (neplatí v případě nutnosti u membránových proteinů)
• Informace o přesném složení pufru ve vzorku
• Hypotéza o fungování systému, detailní informace o vzorku
• Sekvence všech proteinů

Operátoři:

• Tereza Nešporová

Proteinové zesíťování

Tato metoda je založena na zesíťování proteinu pomocí činidel o specifické délce, které po jejich vazbě na protein a následné hmotnostně spektrometrické detekci dávají informace o vzdálenostech dvou postranních řetězců aminokyselin. Touto technikou je možné detekovat a strukturně charakterizovat protein-proteinové interakce, nebo charakterizovat vzdálenosti v rámci struktury individuálního proteinu. Výstup je tabulkový seznam důvěryhodných detekovaných crosslinků a jejich grafické znázornění na proteinové sekvenci a na 3D modelu.

Požadavky:

• Izolované proteiny, nebo jejich očekávané komplexy v roztoku
• Vhodný pufr pro provedení zesíťovací reakce a jeho přesné složení. Vhodný pufr záleží na použitém zesíťovacím činidle; činidla obsahující reaktivní skupinu NHS (DSBU, DSPU, DSSBU, DSS, BS3, DSSO) reagují s primárními aminy, proto lze použít pouze pufry, které je neobsahují! (vhodné pufry jsou například HEPES nebo PBS)
• Sekvence všech proteinů spolu s informací o jejich modifikacích
• Sekvence všech proteinů

Operátoři:

• Petra Junková